Pengeluaran dan pencirian biokimia cendawan tiram laccase NRC 620 dan penilaian kecekapannya dalam penjernihan jus epal.

Selepas 25 hari pengeraman statik pada suhu 28°C, lakase daripada *Pleurotus ostreatus* NRC620 menunjukkan aktiviti tertinggi dalam medium kultur kulat. Nilai pH dan suhu optimum untuk enzim ini masing-masing ialah 3.0 dan 70°C. Selepas 2 jam pengeraman pada suhu 40°C dan 50°C, aktiviti enzim dikekalkan masing-masing sebanyak 68.33% dan 59.61%. Selepas 2 jam pengeraman dalam penimbal sitrat-fosfat (pH 7.0), aktiviti enzim kekal pada 100%. Penambahan 10 mM MgSO₄ dan CuSO₄ masing-masing meningkatkan aktiviti enzim kira-kira 21% dan 35%, manakala NaCl, MnCl₂, KCl, dan CaCl₂ menghalang aktiviti enzim. Menggunakan ABTS sebagai substrat, parameter kinetik (Km dan Vmax) bagi *Pleurotus ostreatus* NRC 620 laccase masing-masing ialah 1.99 mM dan 16,217 μmol min−1 L−1. Rawatan enzimatik sampel jus epal mengurangkan pH dan kelikatan dengan ketara, dan pengurangan ini berkorelasi dengan peningkatan masa penyimpanan. Rawatan laccase mengakibatkan sedikit penurunan dalam jumlah kandungan fenolik jus epal, tetapi tiada pengurangan dalam aktiviti antioksidan diperhatikan.
Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, para penyelidik telah menumpukan pada aplikasi bioteknologi hijau dalam industri makanan. Lakcase merupakan salah satu enzim yang paling berguna dalam industri makanan, dan ia banyak digunakan dalam bidang seperti pemprosesan jus, penaik, penstabilan wain dan peningkatan kualiti organoleptik produk makanan.¹Banyak tumbuhan tingkat tinggi dan mikroorganisma merembeskan lakase,²dan kulat seperti deuteromycetes, ascomycetes, dan basidiomycetes juga boleh menghasilkan laccase.³Lakase (EC 1.10.3.2) ialah sejenis oksidase biru yang mengurangkan oksigen molekul kepada air menggunakan sistem yang terdiri daripada tiga atom kuprum yang berbeza, sekali gus mengoksidakan pelbagai sebatian fenolik dan amina aromatik. Semasa penghasilan jus buah-buahan dan sayur-sayuran, pencoklatan enzimatik dan bukan enzimatik merupakan isu kritikal.⁴Oleh kerana bahan-bahan ini memberi kesan negatif kepada warna, rasa, dan aroma jus, ia mesti dibuang.⁵
Daripada semua buah-buahan, epal adalah yang paling banyak dimakan di seluruh dunia dan di Kesatuan Eropah. Pada tahun 2019, pengeluaran epal berada di kedudukan ketiga di peringkat global, melebihi 87 juta tan.⁶Epal mengandungi pelbagai sebatian fenolik, termasuk flavonoid dan asid fenolik seperti asid kafein dan asid klorogenik.⁷Oleh kerana jus epal biasanya dimakan dalam bentuk jernih, kira-kira 50% hingga 90% komponen fenolik hilang semasa proses penapisan.⁸Hari ini, pengguna cenderung memilih produk yang diproses secara minimum, seperti jus epal keruh dengan kandungan polifenol yang tinggi. Walau bagaimanapun, disebabkan oleh kandungan fenoliknya yang tinggi, jus epal jenis ini amat mudah berubah warna dan menjadi gelap.⁹Pelbagai teknologi, termasuk kaedah rawatan haba seperti pempasteuran pada suhu 60–90°C, digunakan untuk mengurangkan atau mencegah penggelapan jus epal.¹⁰Walau bagaimanapun, menurut penyelidikan oleh Sauceda-Gálvez¹¹, pemprosesan terma boleh memusnahkan bahan kimia yang meruap dan menjejaskan kualiti organoleptik jus epal. Alternatif kepada kaedah pemprosesan terma termasuk karbon dioksida supergenting, sinaran ultraungu, ultrasound, tekanan hidrostatik tinggi atau homogenisasi tekanan tinggi.¹²Kecekapan teknologi ini dan hasil jus buah yang sesuai bergantung pada parameter yang digunakan dan ciri-ciri produk. Penggunaannya yang meluas adalah terhad oleh kos yang tinggi, kesan buruk terhadap kualiti sesetengah produk makanan, atau penyahaktifan enzim yang tidak mencukupi.^13,14
Lakcase boleh digunakan untuk menstabilkan dan menjernihkan jus buah.¹⁵Gökmen dkk.¹⁶mengesyorkan penggunaan laccase untuk penjernihan jus buah kerana ia berkesan menyingkirkan sebatian fenolik dengan menukarkannya kepada polimer atau oligomer yang mudah disingkirkan oleh mana-mana membran ultrapenapisan, membolehkan jus epal mengekalkan warna dan kejelasan yang stabil sehingga enam minggu pada suhu 50°C. Laccase *Trichoderma* yang telah ditulenkan telah diimobilisasi pada manik alumina dan digunakan untuk menyingkirkan sebatian rasa tidak menyenangkan yang disebabkan oleh pencemaran mikrob jus epal secara selektif.¹⁷
Kira-kira 80-90% komponen meruap jus epal adalah ester dan aldehid, yang memberikan aroma unik kepada jus tersebut.¹⁸Lakcase daripada *Trametes versicolor* telah dilumpuhkan pada sokongan murah yang diperbuat daripada gentian semula jadi daripada tempurung kelapa muda untuk penjernihan jus epal.¹⁹Kajian terdahulu telah mengkaji penstabilan jus epal (warna dan kekeruhan) menggunakan kaedah bebas enzim atau imobilisasi, atau digabungkan dengan ultrapenapisan.^5,19Walau bagaimanapun, kesan lakkas kulat terhadap sifat fizikokimia jus epal semasa penyimpanan masih tidak jelas. Oleh itu, tujuan kajian ini adalah untuk mengkaji secara eksperimen perubahan dalam sifat fizikokimia, kandungan sebatian fenolik, dan aktiviti antioksidan jus epal selepas rawatan dengan lakkas kulat dan penyimpanan sejuk selama dua minggu. Lakkas mempunyai keupayaan untuk mengoksidakan sebatian fenolik, yang menjadikannya berpotensi untuk digunakan dalam pelbagai proses perindustrian, termasuk penjernihan jus. Kajian ini mengkaji lakkas daripada *Pleurotus ostreatus* NRC 620, dengan memberi tumpuan kepada keadaan ideal untuk aktiviti dan keberkesanannya dalam penjernihan jus. Walaupun penyelidikan mengenai cendawan tiram (P. ostreatus NRC 620) masih terhad, kajian terdahulu telah mengkaji enzim daripada pelbagai sumber kulat, seperti Trametes versicolor dan Ganoderma lucidum. Tujuan kajian ini adalah untuk menilai potensi aplikasi enzim ini dalam industri makanan dan menonjolkan sifat uniknya, terutamanya pH dan suhu idealnya.
2,2′-Azooxybis(3-etilbenzotiazolin-6-asid sulfonik) (ABTS) telah dibeli daripada Sigma-Aldrich (Kanada). Semua reagen lain adalah gred analitikal.
Pusat Pengumpulan Kultur Mikrob Pusat Penyelidikan Kebangsaan memperoleh strain cendawan tiram yang diketahui NRC620. Selepas subkultur, strain ini disimpan pada agar dekstrosa kentang pada suhu 4°C. Kaedah penyediaan inokulum adalah seperti berikut: Miselium berusia 10 hari yang telah berkembang sepenuhnya diinokulasi ke atas plat agar dekstrosa kentang dan diinkubasi pada suhu 28°C. Selepas 10 hari, tiga blok miselium berdiameter 12 mm telah dikeluarkan dari media agar menggunakan penebuk logam steril dan diletakkan di dalam kelalang Erlenmeyer 250 mL dengan palam kapas yang mengandungi 50 mL medium kultur yang disterilkan (pH 5.0, seperti yang diterangkan sebelum ini oleh Othman et al.²⁰). Kultur diinkubasi pada suhu 28°C selama 18 hari. Kultur kemudian ditapis melalui kertas turas Whatman No. 1, dan supernatan yang terhasil berfungsi sebagai sumber enzim.
Aktiviti lakkas ditentukan menggunakan ABTS sebagai substrat. Campuran tindak balas (2 mL) mengandungi 500 μL 0.3 mM ABTS (dilarutkan dalam penimbal natrium sitrat 0.1 M, pH 4.5) dan jumlah sampel enzim yang diperlukan dicairkan dengan air suling.^21,22Memandangkan laccase boleh mengoksidakan ABTS pada suhu bilik (28 °C ± 2), pengoksidaan ABTS ditentukan dengan mengukur peningkatan penyerapan pada 420 nm (ε₄₂₀= 36,000 cm^-1 M ^-1) menggunakan spektrofotometer UV Agilent Carry-100. Satu unit aktiviti laccase diperlukan untuk mengoksidakan 1 μmol ABTS seminit. Kepekatan protein ditentukan dengan kaedah Bradford menggunakan albumin serum lembu sebagai kawalan dalaman.^23,24
Selepas memperoleh enzim daripada strain cendawan tiram NRC 620, aktivitinya diukur pada selang penanaman yang berbeza selama 25 hari di bawah keadaan statik pada suhu 28 °C.
Untuk mengkaji kesan suhu terhadap aktiviti laccase, eksperimen telah dijalankan dalam julat suhu dari 20 hingga 90 °C. Sebelum menambah enzim dan memulakan tindak balas, penimbal (0.1 M natrium sitrat, pH 4.5) dan substrat (ABTS) telah dicampur dan diinkubasi selama 5 minit pada pelbagai suhu. Kestabilan terma enzim telah dinilai melalui pengeraman dalam penimbal natrium fosfat 0.05 M (pH 7.0) pada suhu 40, 50, 60, dan 70 °C selama 2 jam, masing-masing. Aktiviti sisa kemudiannya dinilai menggunakan substrat ABTS.
Kesan pH terhadap aktiviti laccase telah dinilai menggunakan ABTS sebagai substrat dalam penimbal sitrat-fosfat 0.1 M dengan julat pH 2.5 hingga 7.0. Larutan enzim diinkubasi pada suhu 40°C selama dua jam dalam penimbal sitrat 0.1 M dan Tris (pH 3, 4, 6, dan 7) untuk menilai kestabilan pH. Aktiviti sisa dengan ABTS sebagai substrat telah dikira selepas pengeraman.
Lakase diinkubasi selama 10 minit dalam penimbal natrium fosfat (0.05 M, pH 7.0) yang mengandungi pelbagai ion logam (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+, dan Mn2+) pada kepekatan masing-masing 2.5 mM dan 10 mM. Substrat (ABTS) kemudiannya ditambah untuk memulakan tindak balas, dan aktiviti relatif dinilai.
Pengoksidaan ABTS oleh laccase pada pelbagai kepekatan (0.025–3 mM) diukur pada pH 4.5 untuk menentukan parameter kinetik (Vmax dan Km). Nilai kinetik^pemalarpersamaan Michaelis-Menten dikira menggunakan plot Lineweaver-Burk, yang memplotkan salingan kadar tindak balas sebagai fungsi kepekatan substrat. Pemalar kinetik dikira daripada plot Lineweaver-Burk menggunakan perisian GraphPad Prism versi 6.01.
Selepas membasuh epal dengan teliti menggunakan air paip, ia dipotong dua dan diperah jusnya menggunakan pemerah jus epal Braun MP80 automatik sepenuhnya (buatan Jerman). Jus tersebut ditapis melalui empat lapisan kain kasa. Tiada enzim ditambah kepada kumpulan kawalan, manakala 2.0% laccase (kepekatan paling berkesan yang diuji) ditambah kepada jus epal yang baru disediakan, yang kemudiannya disimpan pada suhu 4°C selama dua minggu.
Keasidan boleh titrat (TA) dan pH ditentukan mengikut kaedah Boulton et al.^al.27pH setiap sampel diukur menggunakan meter pH digital (meter pH JENWAY 3510). Keasidan boleh titrat (TA) dikira berdasarkan asid malik menggunakan formula berikut.
Dengan V dan C masing-masing ialah isipadu (mL) dan kepekatan (0.1 mol/L) larutan natrium hidroksida yang digunakan dalam titrasi. K ialah pekali penukaran asid malik, bersamaan dengan 0.067, dan W ialah jisim (g) jus epal.
Jumlah pepejal terlarut (^TDS) kandungan semua sampel jus ditentukan menggunakan refraktometer poket PAL-1 (ATAGO, Tokyo, Jepun). Selepas setiap pengukuran, kanta optik dibilas dengan air ternyahion, dan setiap sampel jus epal diuji tiga kali. Nilai untuk setiap sampel dikira dengan purata tiga ukuran. Purata ± sisihan piawai untuk setiap sampel jus epal juga dikira dengan purata keputusan ini.
Kelikatan keanjalan sampel jus epal telah dinilai menggunakan viskometer putaran (RV, Rheotest 2, Jerman). Sampel tersebut diletakkan di dalam silinder “S2″ viskometer. Kelikatan ketara diwakili oleh cerun lengkung tegasan ricih lawan kadar ricih, yang dikira daripada tegasan ricih dan lengkung yang sepadan pada pelbagai kadar ricih (dari 1.00 hingga 437.4 s⁻¹). Formula untuk mengira kelikatan ketara adalah seperti berikut:
Dengan η ialah kelikatan ketara (cP), τ ialah tegasan ricih (dyn/cm²), γ ialah kadar ricih (sec⁻¹), dan (τ) dikira menggunakan nilai tork (α) dan silinder (Z) menggunakan formula berikut: τ = Z. α.
Indeks pencoklatan ditentukan mengikut kaedah Meidav ​​​​et^al.29Sampel jus 10 ml telah disentrifugasi pada 2750 xg selama 10 minit. 5 ml supernatan jus telah dicampurkan dengan 5 ml etanol 95%. Penyerapan campuran telah diukur pada 420 nm menggunakan spektrofotometer UV Shimadzu (UV-1601 PC).
Jumlah kandungan fenolik (TPC) ditentukan secara kolorimetri menggunakan reagen Folin-Ciocalteu seperti yang diterangkan oleh Boulton et al.^[27]]. Lengkung piawai asid galik telah dibina untuk kepekatan dari 0 hingga 500 mg/L (^r²= 0.997). Keputusan dinyatakan sebagai setara asid galik (mg GAE/mL).
Tambahkan 125 μL air suling dan 2850 μL larutan FRAP kepada 25 μL jus epal dan biarkan campuran di dalam gelap selama³⁰min. Kemudian ukur penyerapan pada 593 nm menggunakan spektrofotometer UV Shimadzu (UV-1601 PC). Reagen FRAP disediakan dengan mencampurkan 300 mM penimbal asetat (pH 3.6), 20 mM ferum(III) klorida, dan 10 mM 2,4,6-tris(2-piridil)triazina (TPTZ) (dilarutkan dalam 40 mM HCl) dalam nisbah 10:1:1. Lengkung piawai dijana menggunakan Trolox sebagai piawai (^R²= 0.999), dan hasilnya dinyatakan sebagai μM Trolox/mL.
Aktiviti antioksidan jus yang dirawat dan tidak dirawat telah ditentukan menggunakan kaedah DPPH untuk menilai keupayaannya dalam menyingkirkan radikal bebas DPPH.³¹Sepuluh mikroliter jus telah dicampurkan dengan 1 ml larutan DPPH (100 μM) dalam metanol. Selepas tindak balas dalam keadaan gelap selama 30 minit, penyerapan campuran diukur pada 517 nm menggunakan spektrofotometer UV Shimadzu (UV-1601 PC). Keputusan dinyatakan sebagai setara trolox (μM trolox/ml) berdasarkan lengkung penentukuran (_^R2= 0.990).
Data yang diperoleh menunjukkan bahawa penghasilan laktase maksimum diperhatikan dalam cendawan tiram NRC 620 pada akhir hari ke-18 penapaian, mencapai aktiviti 1302 U/L. Ini berfungsi sebagai asas untuk menentukan masa penanaman optimum untuk penghasilan laktase (Rajah 1). Walaupun penghasilan enzim meningkat dengan peningkatan masa penanaman, kadar peningkatan tidak berkadar terus dengan masa penanaman; selepas 21 hari, aktiviti enzim hanya meningkat sebanyak 90 U/L (kepada 1390 U/L). Oleh itu, 18 hari akhirnya dipilih sebagai masa penanaman optimum untuk mengimbangi hasil produk dengan faedah ekonomi daripada peningkatan masa penanaman.
Kesan masa penanaman terhadap hasil laccase dalam Pleurotus ostreatus NRC 620. Tiga blok miselium kulat (12 mm) telah diinokulasi ke dalam 50 ml medium steril dan kemudian dikultur pada suhu 28 °C untuk masa yang berbeza.
Selaras dengan kajian lain, keputusan kami menunjukkan bahawa tempoh kultur ideal untuk mencapai rembesan laccase puncak oleh kulat berkemungkinan antara 7 dan 36 hari.³²Menurut Ezike et al.³³, *Trametes polyzona* WRF03 menghasilkan jumlah lakase tertinggi pada akhir hari kesembilan penapaian, dengan aktiviti khusus protein 1637 U/mg. Tambahan pula, Othman et al.³⁴mendapati bahawa *Trichoderma harzianum* S7113 merembeskan sejumlah besar laktase pada hari kelima kultur. Kadar pengeluaran laktase mencapai aktiviti puncak pada hari keempat belas dan kemudian secara beransur-ansur menurun.³⁴Walaupun rembesan enzim juga boleh berlaku semasa fasa pertumbuhan utama, ia biasanya mencapai puncaknya semasa fasa pertengahan dan dicetuskan oleh penggunaan sumber karbon atau nitrogen.^34,35
Walaupun laccase daripada Pleurotus ostreatus NRC 620 mempamerkan aktiviti yang tinggi pada julat suhu yang luas dari 50°C hingga 80°C, menghampiri aktiviti puncak (69–98%), aktiviti maksimumnya diperhatikan pada 70°C (Rajah 2a). Di luar julat suhu ini, aktiviti enzim menurun pada kira-kira 70°C. Keputusan ini menunjukkan bahawa enzim aktif pada suhu tinggi, mungkin kerana suhu tinggi meningkatkan tenaga kinetik tindak balas.
Kesan suhu tindak balas (a) dan pH (b) terhadap aktiviti lakase dalam *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Suhu antara 20 hingga 90 °C dicapai dengan pra-inkubasi campuran pada suhu yang berbeza selama 5 minit sebelum menambah enzim dan memulakan tindak balas. Kesan pH terhadap aktiviti lakase dinilai menggunakan ABTS sebagai substrat dalam larutan yang mengandungi 0.1 M penimbal sitrat-fosfat pada julat pH 2.5 hingga 7.0.
Menurut Ezike et al.^al.33, suhu optimum untuk *Trametes polyzona* WRF03 laccase ialah 55 °C, yang sama seperti untuk *Ganoderma lucidum*^laccase36dan serupa dengan suhu optimum (50 °C) untuk *Trametes polyzona* KU-RNW02737^laccase . ^Baldrian38menyatakan bahawa, seperti sistem enzim penguraian lignin yang lain, julat suhu ideal untuk laccase adalah antara 50 dan 70 °C.
Keputusan menunjukkan bahawa enzim tersebut mempamerkan aktiviti tertinggi pada pH 3.0, mencapai 94% aktiviti pada pH 3.5. Walau bagaimanapun, ia kekal aktif dalam julat pH yang luas dari 2.5 hingga 7.0 (Rajah 2b). Tambahan pula, ia mempamerkan aktiviti yang lebih tinggi dalam keadaan berasid berbanding keadaan neutral atau alkali. Aktivitinya kekal sekurang-kurangnya 77% dalam julat pH dari 2.5 hingga 4.5, tetapi hanya mencapai kira-kira 38% pada pH 7.0. pH optimum untuk laccase daripada *Trametes polyzona* WRF03 ialah 4.533, yang sama dengan pH untuk laccase daripada *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40, dan *Trametes hirsuta* 41. Walau bagaimanapun, menurut kajian oleh Chairin et al.⁴², pH optimum untuk laccase daripada *Polymorpha f. sp.* WR710-1 ialah 2.2, manakala pH optimum untuk laccase daripada *Polymorpha f. sp.* IBL-04 ialah 5.043. Pengikatan anion hidroksida (perencat laccase) pada atom kuprum laccase T2/T3 mungkin menjadi sebab penurunan aktiviti laccase di bawah keadaan pH neutral atau alkali. Ini boleh mengganggu pemindahan elektron dalaman dari pusat T1 ke pusat T2/T3, justeru^mengehadkanaktiviti enzim23,44
Dengan mengeram enzim pada suhu yang berbeza, didapati bahawa kedua-dua masa pengeraman dan suhu mempengaruhi kestabilan enzim. Terutamanya, lakase daripada *Trametes polyzona* NRC 620 mempamerkan kestabilan yang lebih tinggi pada 40℃ dan 50℃, masing-masing mengekalkan 68.33% dan 59.61% daripada aktiviti awalnya, selepas 120 minit (Rajah 3a). Sebaliknya, di bawah keadaan yang sama (40℃ dan 50℃, 120 minit), lakase daripada *Trametes polyzona* WRF03 masing-masing mengekalkan 64.38% dan 42.92% daripada aktivitinya.³³Sebaliknya, peningkatan masa dan suhu pengeraman mengurangkan kestabilan *Trametes polyzona* NRC 620 laccase; Selepas pengeraman pada 60℃ dan 70℃ selama 60 minit, aktivitinya menurun masing-masing kepada 39.24% dan 1.72% (Rajah 3a). Selaras dengan keputusan eksperimen, laccase daripada *Trametes polyzona* WRF03 menunjukkan kestabilan yang lebih tinggi pada 40 dan 50℃ sepanjang proses rawatan haba.³³Begitu juga, Lueangjaroenkit et^al.37dan Chairin dkk.^al.42melaporkan kestabilan laccase daripada Trametes polyzona KURNW027 dan Trametes polyzona WR710-1 masing-masing pada suhu 50 °C selama 1 jam. Sebagai biomangkin berguna yang boleh digunakan dalam pelbagai bidang bioteknologi, laccase sepatutnya mempunyai kestabilan dan prestasi yang baik dalam julat suhu yang luas.
Kestabilan termostatik (a) dan kestabilan pH (b) laccase daripada *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Kestabilan termostatik dinilai dengan mengeram larutan enzim dalam penimbal natrium fosfat 0.05 M (pH 7.0) pada suhu 40, 50, 60, dan 70 °C selama 2 jam. Kestabilan pH dinilai dengan mengeram larutan enzim dalam penimbal sitrat 0.1 M dan penimbal Tris (pH 3, 4, 6, dan 7) pada suhu 40 °C selama 2 jam. Aktiviti sisa dikira menggunakan ABTS sebagai substrat selepas pengeraman.
Untuk menentukan keadaan optimum bagi penggunaan dan penyimpanan enzim, kami telah mengkaji kesan pH terhadap kestabilan laccase. Pendedahan kepada nilai pH yang berbeza telah mempengaruhi kestabilan struktur protein dengan ketara, sekali gus mempengaruhi kestabilan dan aktiviti molekul enzim. Keputusan menunjukkan bahawa enzim kurang stabil di bawah keadaan berasid, manakala ia menunjukkan kestabilan yang lebih baik pada nilai pH yang lebih tinggi (kawasan neutral dan alkali). Pada nilai pH 7.0, 6.0, 4.0, dan 3.0, kadar pengekalan enzim selepas 120 minit masing-masing adalah kira-kira 100%, 62.54%, 52.39%, dan 11.14% (Rajah 3b). *Strombus multisus* WRF03 laccase menunjukkan kestabilan yang lebih tinggi pada nilai pH neutral (5.5–6.5) dan kestabilan yang lebih rendah pada nilai pH berasid (di bawah 4.0). Selepas 120 minit pada nilai pH 5.5, 6.0, dan 6.5, kadar pengekalan enzim masing-masing adalah kira-kira 82%, 100%, dan 93%.³³Khairin dkk.⁴²menyatakan bahawa laccase daripada Trametes polyzona WR710-1 adalah stabil dalam julat pH 6.0 hingga 7.0, manakala Sayed et al.⁴⁵menunjukkan bahawa laccase lebih stabil di bawah keadaan pH neutral. Walau bagaimanapun, laccase daripada Cerrena unicolor juga mempamerkan kestabilan di bawah keadaan alkali (pH 9.0)⁴⁶Lakase yang dikaji menunjukkan kestabilan yang tinggi pada julat pH yang luas. Ini mungkin merupakan ciri penting untuk aplikasi perindustrian.
Oleh kerana sesetengah ion logam mempunyai kesan perangsang dan perencatan terhadap aktiviti enzim, kesannya terhadap aktiviti enzim mesti dipertimbangkan dalam aplikasi perindustrian. Ini penting kerana ion logam merupakan bahan cemar persekitaran biasa yang boleh menjejaskan kestabilan dan sintesis enzim ekstraselular.⁴⁷Untuk mengkaji kesan pelbagai ion logam pada laccase daripada *Pleurotus ostreatus* NRC 620, kami menjalankan eksperimen yang sepadan. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4, bergantung pada jenis logam yang digunakan, peningkatan kepekatan ion logam daripada 2.5 mM kepada 10 mM memberi kesan negatif kepada fungsi enzim. Contohnya,^Mg²⁺ , ^Co²⁺ , ^Zn²⁺, dan^Cu²⁺boleh merangsang dan mengaktifkan aktiviti enzim, manakala^Na⁺ , ^Mn²⁺ , ^Ca²⁺, dan^K⁺boleh menghalang aktiviti enzim. Pada kepekatan 10 mM, ion Cu²⁺ dan Mg²⁺ merupakan pengaktif aktiviti lakase yang paling kuat daripada *Pleurotus ostreatus* NRC 620, memberikan darjah pengaktifan masing-masing kira-kira 34% dan 20%. Walau bagaimanapun, pada kepekatan 10 mM, ion Ca²⁺ merupakan perencat lakase yang paling kuat, mengurangkan aktiviti enzim sebanyak kira-kira 60%.
Kesan ion logam terhadap aktiviti lakkas Pleurotus ostreatus NRC 620. Lakkas diinkubasi selama 10 minit dalam penimbal natrium fosfat (0.05 M, pH 7.0) yang mengandungi pelbagai ion logam pada kepekatan 2.5 mM dan 10 mM. Tindak balas kemudiannya dimulakan dengan penambahan substrat (ABTS), selepas itu aktiviti relatif diukur.
Keputusan kami adalah selaras dengan keputusan penulis lain yang mendapati bahawa Mg²⁺ dan Cu²⁺ meningkatkan aktiviti *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño et al.⁴⁸ mendapati bahawa lakase daripada *Xylaria* sp. dirangsang sehingga tahap tertentu oleh ion kuprum (Cu²⁺). Tambahan pula, Foroutanfar et al.⁴⁹ dan Si et al.⁵⁰ menjalankan kajian serupa ke atas lakase daripada *Paraconiothyrium variabile* dan *Trametes pubescens*, masing-masing. Tapak pengikat kuprum jenis II (T2) enzim ini boleh tepu dengan Cu²⁺ pada kepekatan tertentu, yang mungkin menjelaskan rangsangan aktiviti lakase pada kepekatan Cu²⁺³⁹ yang lebih tinggi. Oleh kerana lakase kulat reput putih adalah oksidase yang mengandungi pelbagai atom kuprum, kesan ion kuprum terhadap aktiviti lakase adalah pelbagai dan terdiri daripada rangsangan dan perencatan hingga neutral.⁵¹ Sebaliknya, Zhou et al.^[52]melaporkan bahawa^Cu²⁺menghalang aktiviti laccase anai-anai bawah tanah Taiwan (Odontotermes formosanus). Walau bagaimanapun, laccase Cerena sp. HYB07^[53]dan Clitocybe maxima^[54]tidak terjejas oleh ion kuprum.
Kekhususan substrat diwakili oleh parameter kinetiknya (Km dan Vmax); semakin kuat afiniti pengikatan substrat kepada enzim, semakin rendah nilai Km dan semakin tinggi kekhususan substrat.^3,21,55Parameter kinetik (Km dan Vmax) laccase daripada *Pleurotus ostreatus* NRC 620 telah ditentukan menggunakan perisian GraphPad Prism 6.0 dengan memplot plot Lineweaver-Burk (Rajah 5). Apabila menggunakan ABTS sebagai substrat, hasilnya ialah 1.99 mM dan 16217 μmol^{min⁻¹ L⁻¹,}masing-masing. Elsayed dkk.²¹melaporkan bahawa nilai Km untuk pengoksidaan ABTS masing-masing adalah 0.1 mM dan 0.064 mM, menunjukkan afiniti isoenzim Lac A dan Lac B yang tinggi untuk ABTS. Tambahan pula, nilai Vmax ialah 0.182 μmol^min⁻¹dan 0.603 μmol^min⁻¹, masing-masing. Nilai Km yang diperoleh adalah lebih rendah daripada Trametes polyzona WRF03 (8.66 mM); tambahan pula, nilai Vmax mereka (1429 mmol min⁻¹) juga^{lebih rendah}apabila menggunakan ABTS sebagai substrat.33 Begitu juga, nilai Km bagi kepekatan laccase Lentinus squarrosulus MR13 dan Trametes sp. AH28-2 masing-masing adalah 0.0714 mM dan 0.025 mM, dan nilai Vmax adalah 0.0091 mM min−1 dan 0.67 mM min−1 mg−1 (berbanding dengan ABTS)^{, masing-masing.56,57}
Kesan kepekatan ABTS terhadap aktiviti laccase daripada *Pleurotus ostreatus* NRC 620 telah dikaji, dan plot Lineweaver-Burk bagi timbal balas halaju tindak balas awal berbanding kepekatan ABTS telah diplotkan. Tindak balas pengoksidaan ABTS dengan kepekatan laccase yang berbeza (0.025–3.0 mM) telah diukur pada pH 4.5 untuk menentukan parameter kinetik (Vmax dan Km). Pemalar kinetik Michaelis-Menten telah dikira menggunakan plot Lineweaver-Burk bagi timbal balas halaju tindak balas berbanding kepekatan substrat. Pemalar kinetik telah dikira daripada plot Lineweaver-Burk menggunakan perisian GraphPad Prism 6.01.
Enzim penjernih tradisional, seperti pektinase, menghidrolisis bahan pektik, mengurangkan kelikatan dan kekeruhan. Ia berkesan memecahkan polisakarida struktur dan sering digunakan bersama enzim lain, seperti selulase dan hemiselulase, untuk meningkatkan hasil dan kejelasan. Walau bagaimanapun, pektinase tidak secara khusus menyasarkan sebatian fenolik, yang merupakan penyumbang utama kepada kekeruhan dan pencerahan oksidatif, terutamanya dalam jus seperti jus epal dan anggur.⁵⁸Sebaliknya, laccase memangkinkan pengoksidaan sebatian fenolik, mempolimerkannya menjadi molekul yang lebih besar dan tidak larut yang boleh disingkirkan melalui pemendapan atau penapisan. Mekanisme ini bukan sahaja meningkatkan kejelasan tetapi juga memanjangkan jangka hayat jus dengan mengurangkan kemungkinan pencoklatan oksidatif yang disebabkan oleh sebatian fenolik. Tambahan pula, proses penjernihan berasaskan laccase boleh dijalankan di bawah keadaan pemprosesan ringan (pH 3.5–5.5, suhu 25–40 °C), menjadikannya sesuai untuk jus yang halus tanpa menjejaskan sifat pemakanan atau organoleptiknya.⁵⁹Kajian telah menunjukkan bahawa rawatan pektinase boleh menjernihkan jus dalam 1–2 jam, manakala rawatan lakase biasanya memerlukan masa tindak balas yang lebih lama (3–6 jam) untuk mengurangkan sebatian fenolik sepenuhnya. Walau bagaimanapun, proses ini boleh dioptimumkan dengan melumpuhkan enzim atau dengan menggabungkan lakase dengan kaedah penjernihan mekanikal.⁶⁰Dalam kajian ini, profil enzim ekstrak mentah mendedahkan aktiviti lakase dan α-amilase yang ketara, manakala aktiviti pektinase dan xilanase adalah sangat rendah, dan aktiviti selulase tidak dikesan. Oleh itu, pengurangan kekeruhan dan kandungan fenolik adalah disebabkan terutamanya oleh tindakan lakase, manakala perubahan kelikatan mungkin sebahagiannya disebabkan oleh tindakan amilase.
Jadual 1 menunjukkan parameter fizikokimia jus epal yang baru diperah dan sampel yang dirawat dengan laktase. Keputusan menunjukkan bahawa hasil jus epal yang baru diperah (71.59%) adalah lebih rendah daripada sampel yang dirawat dengan laktase (87.34%). Keputusan ini selaras dengan penemuan Pilnik dan Orange.⁶¹, yang menunjukkan bahawa penggunaan enzim dalam pemprosesan buah boleh meningkatkan hasil jus, meningkatkan penapisan, dan mendapatkan jus jernih yang berkualiti tinggi untuk kepekatan. Peningkatan hasil jus adalah disebabkan terutamanya oleh peningkatan kandungan gula larut dalam jus. Semasa hidrolisis enzimatik buah-buahan, mesoglea dan pektin dalam dinding sel produk dimusnahkan dan ditukar menjadi bahan larut seperti gula neutral dan asid.^62.Nilai pH jus epal yang dirawat dengan enzim adalah jauh lebih rendah daripada kumpulan kawalan (P < 0.05), dan nilai pH kedua-dua kumpulan meningkat dengan ketara semasa penyimpanan (Jadual 1). Keputusan ini selaras dengan keputusan Mark et al.⁶³, yang menyatakan bahawa pH jus buah gajus menurun selepas penyimpanan selepas rawatan haba. Degradasi pektin dan pembentukan asid galakturonik selepas rawatan enzim mungkin bertanggungjawab untuk peningkatan pH semasa penyimpanan. pH sampel yang dirawat dengan enzim kekal antara 4.05 dan 4.31 sepanjang penyimpanan, manakala pH jus epal yang tidak dirawat adalah antara 4.12 dan 4.33.
Jumlah keasidan (TA) bagi kedua-dua sampel yang tidak dirawat dan yang tidak dirawat dengan laktase menunjukkan trend penurunan dengan peningkatan masa penyimpanan (Jadual 1). Penurunan keasidan adalah disebabkan oleh penukaran asid organik kepada karbohidrat atau tindak balas enzimatik, serta pengoksidaan semasa penyimpanan jus.⁶⁴Jumlah keasidan jus epal kawalan dan sampel yang dirawat enzim adalah lebih rendah berbanding jus lain (jus strawberi 0.9%, jus plum 2.2%, jus kumquat 1.0%, jus aprikot 2.4%, jus oren 0.8%), tetapi serupa dengan jus lain (contohnya, jus pir 0.3%).⁶²Perbezaan dalam jus epal segar yang tidak dirawat ini mungkin disebabkan oleh pelbagai faktor seperti keadaan pertumbuhan, faktor genetik, tahap kematangan dan kaedah pemprosesan.⁶⁵Penurunan jumlah keasidan jus epal kawalan dan jus epal yang dirawat dengan laccase adalah konsisten dengan keputusan yang dibentangkan oleh Singh et al.⁶⁶mengenai penurunan jumlah keasidan jus epal Jin Nuo selepas 74 hari penyimpanan. Sebaliknya, Oshmiansky dan Wojdylo⁶⁷tidak menemui sebarang perubahan ketara dalam keasidan jus epal apabila mengkaji kesan kaedah penjelasan tradisional.
Keputusan yang ditunjukkan dalam Jadual 1 menunjukkan bahawa nilai jumlah pepejal terlarut (TSS) jus epal yang dirawat dengan laktase adalah lebih tinggi daripada sampel yang tidak dirawat. Keputusan ini selaras dengan kajian yang diterbitkan.⁶⁸Tambahan pula, Jadual 1 menunjukkan bahawa nilai TSS bagi kumpulan jus epal kawalan adalah 9.58 pada titik masa awal dan mencapai 11.05 pada akhir tempoh penyimpanan. Nilai-nilai ini adalah lebih rendah daripada nilai TSS jus epal segar yang dilaporkan oleh Hamid et al.^{. 69}(masing-masing 11.2 dan 11.80). Nilai TSS bagi sampel jus epal yang dirawat dengan laccase meningkat dengan ketara, bermula dari 11.23 dan mencapai 12.93 selepas dua minggu penyimpanan pada suhu 4°C (Jadual 1). Peningkatan TSS yang serupa semasa penyimpanan juga diperhatikan dalam buah sitrus, lemon, dan oren manis. Peningkatan jumlah pepejal larut (TSS) semasa penyimpanan mungkin disebabkan oleh hidrolisis polisakarida (kanji) kepada monosakarida (gula), peningkatan kepekatan akibat dehidrasi jus, dan degradasi pektin dalam jus kepada pepejal larut. Peningkatan jumlah pepejal larut (TSS) mungkin disebabkan oleh peningkatan gula larut, yang mungkin dibentuk oleh penukaran pektin atau selulosa kepada gula larut oleh pektin atau selulase, masing-masing, atau oleh hidrolisis kanji kepada gula, seperti yang dilaporkan oleh Hamed et al.^69.Kesan laccase terhadap sifat jus epal boleh diperhatikan secara visual, kerana jus epal yang dirawat dengan laccase menunjukkan kebolehaliran yang lebih baik dan kelikatan yang lebih rendah berbanding jus yang tidak dirawat. Pemerhatian ini direkodkan dalam Jadual 1; Kelikatan sampel yang dirawat dengan enzim ialah 1.87 cP, manakala kelikatan sampel kawalan ialah 2.95 cP. Penurunan kelikatan yang ketara ini berkemungkinan disebabkan oleh kapasiti pegangan air yang lebih tinggi bagi bahan seperti pektin dan pembentukan struktur rangkaian yang padu.
Dalam kajian ini, kesan laccase terhadap indeks pencerahan (BI) jus epal telah dikaji dengan mengukur penyerapan pada 420 nm menggunakan spektrofotometer. Keputusan ditunjukkan dalam Jadual 1. Semasa penyimpanan, BI sampel jus epal dalam kedua-dua kumpulan yang dirawat dan tidak dirawat menunjukkan trend peningkatan secara beransur-ansur. BI mencerminkan tahap pencerahan dan boleh berfungsi sebagai^{yang penting}penunjuk tindak balas pencoklatan enzimatik dan bukan enzimatik. Penyerapan meningkat dengan ketara semasa penyimpanan (P < 0.05). Pada akhir penyimpanan,_A420Nilai sampel jus epal dalam kumpulan kawalan dan kumpulan yang dirawat enzim meningkat masing-masing sebanyak kira-kira 217% dan 121% (Jadual 1). Keputusan menunjukkan bahawa rawatan enzim dapat mengurangkan tahap keperangan secara berkesan sebanyak kira-kira 56%. Keputusan Bezerra et al.^[19]] adalah konsisten dengan keputusan kami; Mereka menggunakan serat lakase-glutaraldehida-kelapa untuk menjernihkan jus epal, sekali gus mengurangkan warna asalnya sebanyak 61%.
Walaupun polifenol dalam jus buah mempunyai kesan pemakanan dan terapeutik yang positif pada tubuh manusia, ia juga boleh bertindak balas dengan protein, menyebabkan jus menjadi keruh, pemendapan atau kekeruhan, sekali gus mengubah rasa dan aroma produk serta mengurangkan jangka hayatnya.⁷¹Tujuan kajian ini adalah untuk mengurangkan kandungan sebatian fenolik jus epal dengan selamat menggunakan laccase daripada Pleurotus ostreatus NRC 620. Keputusan yang ditunjukkan dalam Jadual 1 menunjukkan bahawa jumlah kandungan sebatian fenolik jus epal yang dirawat dengan laccase berkurangan dengan ketara sebelum penyimpanan pada suhu 4 °C. Tambahan pula, jumlah kandungan sebatian fenolik juga menurun semasa penyimpanan dalam kedua-dua sampel yang dikaji (Jadual 1). Kajian oleh Sandri et al.⁷²menunjukkan bahawa jus epal yang dirawat dengan enzim dapat mengekalkan aktiviti antioksidan dan kandungan sebatian fenoliknya. Walau bagaimanapun, hasil kajian oleh Lettera et al.⁷³menunjukkan bahawa rawatan jus oren dengan lakkas kulat boleh mengurangkan kandungan sebatian fenolik di dalamnya sehingga 45%.
Sebatian fenolik telah terbukti mempunyai sifat seperti penyingkiran radikal bebas, pengurangan dan pelindapkejutan oksigen singlet, pemindahan atom hidrogen, dan pendermaan elektron kepada radikal bebas, menjadikannya antioksidan yang kuat.⁷⁴Oleh itu, dalam kajian ini, kaedah berasaskan DPPH dan FRAP telah digunakan untuk menilai kesan laccase terhadap aktiviti antioksidan jus epal yang disimpan di dalam peti sejuk selama 14 hari (Jadual 2). Kedua-dua kaedah menunjukkan peningkatan aktiviti antioksidan semasa penyimpanan, yang mungkin disebabkan oleh peningkatan sebatian fenolik bebas atau pembentukan produk tindak balas Maillard (MRP), dengan produk tindak balas Maillard berkemungkinan menjadi punca peningkatan aktiviti antioksidan.⁷⁵Tindak balas pencoklatan bukan enzimatik (termasuk degradasi asid askorbik, tindak balas Maillard dan degradasi gula yang dimangkinkan oleh asid) menghasilkan pigmen coklat (melanoidin). Produk degradasi asid askorbik perantaraan dan produk degradasi gula (seperti sebatian karbonil) boleh bertindak balas dengan asid amino melalui tindak balas Maillard.⁷⁶Walaupun proses keperangan buah-buahan dan sayur-sayuran semasa penyimpanan telah dikaji secara meluas, pemahaman kita tentang tindak balas ini masih terhad.⁷⁷Berbanding dengan kaedah FRAP, jus epal yang dirawat dengan laktase menunjukkan aktiviti antioksidan yang jauh lebih rendah melalui kaedah DPPH (Jadual 2), dan aktiviti antioksidan semua sampel meningkat dengan ketara dengan peningkatan masa penyimpanan. Dua kaedah berbeza untuk menentukan aktiviti antioksidan telah digunakan dalam kajian ini kerana prinsipnya berbeza. Kaedah DPPH mengukur keupayaan untuk meneutralkan radikal bebas, manakala kaedah FRAP mengukur keupayaan untuk mengurangkan ion besi. Oleh itu, adalah disyorkan untuk menggunakan pelbagai kaedah untuk menentukan aktiviti antioksidan bagi lebih memahami aktiviti antioksidan sampel yang dikaji.⁷⁸
Salah satu penemuan utama kajian ini ialah *Pleurotus ostreatus* laccase NRC 620 mempamerkan aktiviti optimum pada suhu 70°C dan pH 3.0. Berbanding dengan laccase kulat lain yang biasa digunakan untuk penjernihan jus, seperti *Trametes versicolor* dan *Ganoderma lucidum* laccase, *P. ostreatus* NRC 620 mempamerkan kestabilan haba yang lebih tinggi dan pH yang lebih berasid. Laccase daripada *Trametes versicolor* dan *Ganoderma lucidum* biasanya mempamerkan aktiviti optimum dalam julat 50-60°C dan pada nilai pH antara 3.5 dan 5.0. Perbezaan ini boleh menyumbang kepada peningkatan kecekapan penjernihan jus, terutamanya untuk jus berasid di mana kestabilan pada nilai pH yang lebih rendah adalah kritikal. Ciri unik *P. Berbanding dengan laccase kulat lain yang dikaji, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 mempamerkan keupayaan untuk berfungsi dengan berkesan dalam keadaan yang lebih mencabar. Suhu aktiviti optimumnya yang lebih tinggi menunjukkan potensi kelebihan dalam aplikasi perindustrian, seperti kadar tindak balas yang lebih pantas dan pencemaran mikrob yang berkurangan. pHnya yang rendah, yang sangat sesuai dengan sifat berasid banyak jus, mungkin berguna dalam proses penjernihan jus. Keputusan ini mewajarkan penerokaan lanjut untuk aplikasi berskala besar, menjadikan *Pleurotus ostreatus* NRC 620 alternatif yang berdaya maju kepada sumber laktase kulat tradisional. Berbanding dengan kajian terdahulu, kami mendapati bahawa suhu optimum ialah 60°C dan pH optimum ialah 3.0. Selepas tindak balas pada 60°C selama 80 minit, laktase *Ganoderma lucidum* dikekalkan.⁴⁶% daripada aktivitinya.79 Menurut Kurniawati dan Nicelle⁸⁰, enzim *Ganoderma lucidum* mempamerkan kestabilan yang sangat baik hingga sederhana pada suhu 25°C dan nilai pH antara 5.0 hingga 8.0, dan kestabilan pada pH 6.0 dan suhu antara 10 hingga 30°C. Dalam kajian ini, kami mendapati bahawa pH dan suhu optimum untuk aktiviti enzim untuk *Pleurotus ostreatus* masing-masing adalah 3.0 dan 70°C. Selepas pengeraman pada suhu 40°C dan 50°C selama dua jam, enzim tersebut masing-masing mengekalkan 68.33% dan 59.61% daripada aktivitinya. Tambahan pula, Pleurotus ostreatus NRC 620 laccase mempamerkan aktiviti yang tinggi dalam julat suhu yang luas dari 50°C hingga 80°C, hampir mencapai aktiviti maksimum (69%–98%), dengan aktiviti maksimum diperhatikan pada 70°C.
Kesimpulannya, lakkas cendawan tiram NRC620, yang diperoleh di bawah keadaan statik, menunjukkan aktiviti dan kestabilan optimum merentasi pelbagai keadaan pH dan suhu, menunjukkan kestabilan yang lebih baik berbanding sumber enzim lain. Penambahan 10 mM MgSO₄ dan CuSO₄ masing-masing meningkatkan aktiviti enzim sebanyak kira-kira 21% dan 35%. Apabila diproses menjadi jus epal, enzim tersebut mengurangkan pH dan kelikatan, manakala kandungan fenolik hanya berkurangan sedikit semasa penyimpanan.
Keputusan ini mengesahkan potensi laktase dalam industri makanan, terutamanya dalam penjernihan minuman. Dengan menguraikan sebatian fenolik secara khusus, laktase bukan sahaja mengurangkan kekeruhan dan meningkatkan kejelasan tetapi juga mengekalkan kualiti jus buah-buahan di bawah keadaan operasi yang sederhana. Tidak seperti agen penjernihan tradisional seperti gelatin, bentonit dan gel silika, laktase tidak menghasilkan sisa atau menghilangkan aroma yang menyenangkan daripada minuman, menjadikannya pilihan yang lebih mesra alam dan lestari. Tambahan pula, berbanding dengan enzim dan kaedah penapisan lain, laktase menawarkan penyelesaian yang disasarkan dan kos efektif tanpa menjejaskan kualiti produk.
Kyomuhimbo, HD dan Brink, HG. Aplikasi dan strategi imobilisasi laccase yang mengandungi kuprum; satu ulasan. Heliyon 9, e13156 (2023).